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烈冰助力||單細胞RNA測序鑒定半月板祖細胞并揭示半月板退變機制 時間:2020-01-16

半月板在關節穩定、減震、接觸力分布和關節潤滑等方面起著重要作用,其包含不同的細胞類型,主要包括軟骨細胞形態細胞和纖維細胞形態細胞。然而,半月板的細胞類型組成、分布和相應的生物標志物,以及治療半月板退變的生物靶點仍不清楚。

2019年12月7日,中山大學附屬第一醫院廖威明教授課題組和張志奇教授課題組通過ScRNA-Seq詳細描繪半月板的細胞組成,鑒定出一種在半月板組織工程中具有應用前景的祖細胞,并證明了半月板的退變機制。并且通過TGFβ1治療有效緩解半月板退變提出一種半月板退變的潛在治療策略。此次研究工作中的單細胞RNA測序實驗與數據分析由烈冰科技參與支持。該研究成果以“Single- cell RNA- seq analysis identifies meniscus progenitors and reveals the progression of meniscus degeneration”為題發表于《Annals of the Rheumatic Diseases》(IF=14.299)期刊。


分析思路:

測序樣本信息:

健康半月板樣本、退變半月板樣本

測序平臺:

BD Rhapsody系統

測序數據量:

100G


研究結果:

1. ScRNA-Seq揭示健康人半月板的細胞組成類型

研究者首先對健康人的半月板組織進行ScRNA-Seq,對3639個細胞進行t-SNE分析,共分出7個亞群,其中包含兩個新發現的細胞亞群

①    內皮細胞(EC);②軟骨細胞祖細胞 (CPC);③調節性軟骨細胞(RegC);④纖維軟骨細胞(FC);⑤預肥大軟骨細胞(PreHTC);⑥纖維軟骨細胞祖細胞(FCP);⑦增殖纖維軟骨細胞(ProFC)。并進一步通過免疫組化來確定各細胞亞群的分布,FCP主要分布于半月板表面,RegC在半月板中部,EC存在于紅區血管周圍 ,而PreHTC分布于白區。

圖1 健康人半月板的單細胞圖譜


2.健康人半月板細胞的分化軌跡分析

研究者通過擬時序分析發現FCP和EC存在于分化軌跡的起始處。為了進一步探究FCP是否具有祖細胞的性質,根據高表達基因分選出CD146+原代半月板細胞,并對其進行分化和克隆能力的驗證。通過集落形成和多向分化潛能分析實驗驗證CD146+細胞可以向成骨細胞和脂肪細胞分化并形成集落。提示在健康人半月板細胞中,FCP具有祖細胞的特性。

圖2 人半月板祖細胞的鑒定

為了研究FCP的分化軌跡,研究者選取了FCP、ProFC、FC、PreHTC和RegC重新構建了一條新的分化軌跡(圖3A)。軌跡起始部位由FCP和ProFC組成,其后為PreHTC,而末端Fate 1為FC,末端Fate 2由RegC組成(圖3B)。進一步分析FCP向 Fate1和Fate2分化過程中各亞群細胞基因表達模式(圖3C、3D)。

為了確定細胞分化軌跡,研究者分析了各亞群細胞的差異表達基因及表達模式,并研究了體內半月板發育過程,觀察1、2、3、4、8、26和52周小鼠半月板中marker基因的表達情況(圖3E):COL1A1出生后表達逐漸增強,在4周時達到高峰,隨后表達量逐漸降低;MYLK在3周后,表達量顯著下降。體內實驗的基因表達趨勢與測序分析得出的趨勢相一致,進一步驗證了FCP的分化軌跡。

圖3 FCP分化的單細胞軌跡分支點分析

3.健康人群半月板與退變半月板單細胞圖譜的對比分析

研究者首先通過觀察組織結構變化,發現退變半月板的膠原纖維結構紊亂(圖4A)。然后對健康和退變半月板進行ScRNA-Seq分析(圖4B-E),發現退變半月板的各細胞亞群占比發生顯著變化,并發現三個新的亞群:(1)單核細胞來源的樹突狀細胞(MoDC);(2)肥大軟骨細胞(HTC);(3)退變半月板祖細胞(DegP)。

圖4 健康人半月板與退變半月板單細胞圖譜的對比分析


4. 單細胞分化軌跡提示DegP是半月板退變的關鍵因素

研究者通過集落形成和多向分化潛能分析實驗發現DegP(CD318+細胞)可以形成集落并向多種細胞分化,證明在退變半月板中,DegP具有祖細胞特性。因此,研究者重新選取FCP、ProFC、CPC和DegP四個亞群來構建分化軌跡,軌跡起始端主要由FCP和ProFC組成,Fate 1和Fate 2分別由DegP和CPC組成(圖5A、5B)。

通過比對健康與退變半月板的命運分支點基因表達情況,發現在半月板的退變過程中,FCP向DegP的分化是異常的細胞狀態(圖5C、5D)。研究者對此采用免疫組化染色實驗證實DegP標記基因(GAS1、DNER)在半月板病變且細胞增殖的區域顯著高表達(圖5E)。

此外,研究者還利用IL-1β分別刺激健康和退變半月板細胞,得到相似的結果:CD146+細胞減少和CD318+細胞增加,提示促炎介質IL-1β誘導DegP活化是半月板退變的機制。

圖5 單細胞分化軌跡提示DegP是半月板退變的關鍵因素


5. TGFβ信號通路的激活可以抑制退變半月板CD318+細胞的增加

由于TGFβ信號通路激活后會增強半月板干細胞的分化能力。研究者觀察到在健康半月板細胞中TGFβ信號通路被上調,而且其配體TGFβ1顯著高表達(圖6A-D)。因此,研究者利用TGFβ1體外刺激退變半月板細胞,發現CD318+細胞數量明顯減少、COL1A1(FCP標記基因)表達量增加(圖6E、6F),提示TGFβ可能有延緩半月板退變的作用。

圖6 TGFβ信號通路的激活可以抑制退變半月板Cd318+細胞的增加


綜上所述,研究者通過使用ScRNA-Seq全面描繪了健康及退變半月板細胞的圖譜,并確定了在半月板組織工程中具有重要意義的CD146+祖細胞。其次,研究者還證實了促炎介質誘導DegP活化是半月板退變的可能機制,TGFβ可以減少DegP的比例,這可能成為延緩半月板退變的治療策略。



原文鏈接:

http://dx.doi.org/10.1136/annrheumdis-2019-215926

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