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產品簡介

空間轉錄組學(Spatial Transcriptomics)是指在組織切片上完成,保留樣本空間信息的組學研究??臻g轉錄組可展示組織切片中不同區域的基因表達情況,揭示精細病理區域中激活的信號通路,完成分子特征驅動病理特征的機制解析??臻g轉錄組學完成了病理數字化結合病理影像化的技術革新,對于診斷標志物、耐藥位點以及靶向藥物的研發,免疫治療等新興領域都具有重要作用。

我們的優勢

1、 擁有先進的冷凍切片機LEICA CM1950。搭配切片經驗豐富的實驗團隊,對多種組織類型的切片厚度與切片溫度進行測試優化,獲得示組織內真實表達水平的高質量冷凍切片提供硬件和技術保障。

2、 擁有行業先進的3DHISTECH公司的PANNORAMIC系列的數字切片掃描儀,可以同時實現明場與熒光場下冷凍切片的快速掃描成像;Z-Stack多層聚焦掃描及Extended Focus 景深擴展多層融合掃描模式,進一步提升分辨率和清晰度,保證切片高分辨的數字圖像信息精準采集;

3、 具備豐富的空間轉錄組測序和數據分析經驗,具有完善的空間轉錄組聯合單細胞轉錄組數據分析方案,能夠實現個性化、定制化地數據分析服務。

4、 烈冰提供空間轉錄組全流程服務,包括樣本包埋、切片、選片、HE染色、組織透化、建庫測序、以及后續的FISH驗證等各個步驟,為您提供無憂服務。

樣本要求

樣本類型:
1.冰凍組織: 新鮮樣本經液氮預冷的異戊烷速凍,-80℃保存;
2.OCT包埋組織: 新鮮組織異戊烷速凍后進行OCT包埋,或新鮮組織直接OCT包埋后-80℃速凍 注意標明樣本方向,樣本于-80℃保存。

注意事項:

1.樣本處理和運輸過程需要再低溫環境。
2.如果樣本充足,最好準備2份及以上,一份用于RNA質控和后續的正式切片實驗;一份留作備用;
3.如果組織樣本珍貴稀缺,可以酌情減少樣本數量。

實驗流程


1. 冷凍切片的制備:注意提前將冷凍組織與玻片放入-20℃冷凍切片機箱體中平衡30分鐘以上,再進行切片;

2. HE染色、拍照成像:組織切片貼合在玻片上,通過甲醛固定、H&E染色并在明場下拍照得到組織切片的形態結構;

3. 組織優化:采用組織酶解的方式進行透化,使細胞中的mRNA釋放并結合到芯片相鄰的捕獲探針上,反轉錄合成cDNA后,移除組織,進行熒光場掃描成像,根據熒光強度判斷最優的透化時間。

4. 透化和cDNA合成:采用組織酶解的方式,選取最佳的透化時間進行透化,芯片的捕獲探針捕獲到mRNA后,反轉錄合成cDNA;

5. 文庫構建:對cDNA進行隨機引物PCR擴增;

6. 上機測序:采用Illumina Hiseq或NovaSeq測序平臺進行測序。

數據分析流程

結果示例

1、冷凍切片的制備
根據組織類型設定好切片溫度與厚度,將質檢合格的冷凍組織和10x玻片先放-20℃冷凍切片機箱體中平衡30分鐘以上,再進行切片

2、明場掃描成像
采用PANNORAMIC系列的數字切片掃描儀,實現明場下冷凍切片的快速掃描成像,以觀察所選組織切片的形態結構

3、透化
以貼合在帶有mRNA結合捕獲探針的載玻片上的組織切片為對象,根據預透化確定的最佳透化時間,采用組織透化酶進行透化,釋放細胞中的mRNA。

4、文庫構建、上機測序
以捕獲的mRNA反轉錄產物PCR擴增開始進行文庫構建,獲得每個樣本的測序文庫。接著采用Illumina Hiseq或NovaSeq高通量測序儀對文庫進行測序,獲得每個樣本的測序數據。

5、原始數據質量控制
以原始數據為研究對象,采用Fastp軟件對于低質量序列,未檢測序列,接頭序列進行過濾,并對于過濾前后數據的GC比值,堿基質量,長度分布,接頭留存,Duplication比率等指數進行分析,將過濾后數據命名為Clean Data。

6、點陣判斷
以測序數據為研究對象,采用barcode處理算法,對測序數據中的cell barcode信息及其對應的counts數進行統計,判斷測序樣本中實際檢測到的點陣數,獲得真實的空間轉錄組測序信息。

7、基因組比對
以cell barcode對應的reads為研究對象,采用RNA比對算法,將測序數據比對到物種對應的基因組上,獲得基因組比對的bam文件,并基于bam文件進行信息統計,得到基因組比對率等信息。

8、空間轉錄組測序數據標化
以基因組比對后的bam文件以及基因組注釋文件為研究對象,將比對到同一基因上的UMI進行合并,并去除其中重復的UMI序列,得到每個基因的UMI數量,統計每個空間點陣中檢測到的基因數以及轉錄本數量,并得到表達量矩陣表,同時進行染色。

9、空間點陣聚類與亞群分析
以基因組比對結果以及表達量結果為研究對象,對測序檢測到的細胞進行過濾,并根據表達矩陣進行細胞的降維和聚類,將空間點陣分為不同的Cluster聚類簇,采用UMAP算法和tSNE算法展示,并在空間染色片上進行展示。

10、點陣Cluster聚類簇Marker分析
以點陣分群結果為研究對象,鑒定不同點陣亞群中的Marker基因,并對Marker基因的表達分布進行可視化展示。 Aldoc 星狀膠紙;Gad1 抑制性神經元;Gad2 抑制性神經元;Mbp 少突膠質細胞;Slc17a6 興奮性神經元;Slc17ca7 興奮性神經元

11、解剖區域細分
以每個點陣中的表達量數據為研究對象,根據用戶指定的解剖區域(臨近切片或者當前切片)進行結果展示,包括基因區域的集中展示。

12、信號通路Scoring分析
以每一個點陣的基因表達為研究目標,采用ssGSEA算法,對于每一個點陣的信號通路代謝通路的富集程度進行打分,繪制調控強度的打分結果圖展示。

13、基因集染色分析
以點陣群體的表達為研究目標,采用預設基因集,對于點陣群體的基因集表達的程度進行分析和著色

14、差異基因篩選
以點陣分群結果為研究對象,針對特定點陣亞群,進行點陣亞群間差異表達基因篩選,獲得細胞亞群間差異表達基因,并繪制火山圖和熱圖。

15、功能分析(GO Analysis)& 信號通路分析(Pathway Analysis)
以Marker基因/差異基因為研究對象,采用NCBI/UNIPROT/SWISSPROT/ AMIGO等GO數據庫,對于基因群體進行功能分析得到該基因群體所顯著性富集的功能條目,命名為GO Analysis。以Marker基因/差異基因為研究對象,采用KEGG數據庫,對于基因群體進行信號通路分析,得到該基因群體所顯著性富集的信號通路條目,命名為Pathway Analysis。

16、點陣群體基因富集分析
以點陣群體的表達,采用Qusage算法對于每一個點陣群體的基因的富集性的基因集合進行描述,得到每一個群體的基因集合的富集差異。

17、細胞通訊分析
采用Cellphone算法,針對不同點陣亞群cluster之間或內部的Ligand-Receptor關系進行分析,展示了微環境中跨細胞類型的通訊關系,幫助解析微環境的形成機制和調控機理。

高級數據分析

文獻示例

1. Willis EF, MacDonald KPA, Nguyen QH, et al. Repopulating Microglia Promote Brain Repair in an IL-6-Dependent Manner. Cell. 2020;180(5):833‐846.e16.(IF=36.216)

2. Baccin C , Al-Sabah J , Velten L , et al. Combined single-cell and spatial transcriptomics reveal the molecular, cellular and spatial bone marrow niche organization[J]. Nature Cell Biology, 2020, 22(1):1-11.(IF=17.428

3. Moncada R, Barkley D, Wagner F, et al. Integrating microarray-based spatial transcriptomics and single-cell RNA-seq reveals tissue architecture in pancreatic ductal adenocarcinomas. Nat Biotechnol. 2020;38(3):333‐342.IF=31.864

4. Asp M, Giacomello S, Larsson L, et al. A Spatiotemporal Organ-Wide Gene Expression and Cell Atlas of the Developing Human Heart. Cell. 2019;179(7):1647‐1660.e19. (IF=36,216)

5. Maniatis S, ?ij? T, Vickovic S, et al. Spatiotemporal dynamics of molecular pathology in amyotrophic lateral sclerosis. Science. 2019;364(6435):89‐93. (IF=41.037)

6. Thrane K, Eriksson H, Maaskola J, Hansson J, Lundeberg J. Spatially Resolved Transcriptomics Enables Dissection of Genetic Heterogeneity in Stage III Cutaneous Malignant Melanoma. Cancer Res. 2018;78(20):5970‐5979. (IF=8.378)

7. Berglund E, Maaskola J, Schultz N, et al. Spatial maps of prostate cancer transcriptomes reveal an unexplored landscape of heterogeneity. Nat Commun. 2018;9(1):2419.(IF=11.878)

8. Giacomello S, Salmén F, Terebieniec BK, et al. Spatially resolved transcriptome profiling in model plant species. Nat Plants. 2017;3:17061. Published 2017 May 8. (IF=13.297)

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