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技術干貨||揭秘空間轉錄組實驗核心步驟——掃描成像和組織透化優化

時間:2020-07-03    |    閱讀量:742

自烈冰生物關鍵技術——冷凍切片制備亮相以后,很多老師都對烈冰的空間轉錄組測序保持極大地關注,尤其之前小編請到了實驗團隊大神Dr.Han親自上手,結合實際操作詳細介紹了樣本制備的整個過程,老師們紛紛反饋注意到了很多之前忽略的細節操作。

那么,本期小編就持續高能輸出技術干貨,介紹一下烈冰生物的數字切片掃描成像方案以及空轉實驗的核心步驟——組織透化優化,全程高能,做好準備哦~

掃描成像的分辨率是影響組織切片原始圖像信息精度和準確度的重要因素。將組織切片掃描為包含所有組織信息的高分辨率電子圖片,可以在電腦上進行放大和縮小,如同在顯微鏡上操作一樣,真正將物質的切片標本快速數字化,實現病理數字閱片。

組織透化是指將組織切片放置在含有與 RNA 結合捕獲探針的載玻片上,固定染色后,通過透化酶處理的方式,使細胞中的 mRNA 釋放并結合到相應的捕獲探針上,從而獲取基因表達信息。 這個過程需要對透化時間進行一個很好的把控,透化時間不夠,mRNA無法充分釋放出來;透化時間過長,mRNA可能會擴散到附近區域,影響分析結果的準確性。根據實驗人員的操作手法、組織類型、切片厚度等因素不同,最佳透化時間也不盡相同。因此在正式的組織透化實驗之前,通常需要對組織進行透化優化,以確定最佳透化時間。


下面就以腦組織的冷凍切片為例詳細介紹一下組織透化時間的優化過程。

首先,準備好組織優化的冷凍切片,進行固定、HE染色,然后在明場光源下進行掃描成像。

固定及HE染色具體步驟:

  1. 1 )將芯片放在PCR儀上,37°C下孵育1分鐘。

  2. 2 )將芯片完全浸入預冷的甲醇中在-20°C孵育30分鐘。

  3. 3 )玻片取出,擦干背面液體,在玻片上滴加500μl異丙醇,室溫孵育1分鐘;

  4. 4 )將芯片上試劑去除,晾干玻片;

  5. 5 )加入1 ml蘇木精,室溫孵育7分鐘;

  6. 6 )去除蘇木精試劑,然后將芯片先浸入無酶水中清洗后,晾干;

  7. 7 )加入1 ml Bluing Bu?er,室溫孵育2分鐘;

  8. 8 )去除試劑,將芯片浸入無酶水清洗后,擦干玻片背面液體;

  9. 9 )加入1 ml伊紅混合物,室溫孵育1分鐘;

  10. 10) 去除試劑,將芯片浸入無酶水中清洗,晾干直至組織不透明。

  11. 11 )在37°C下孵育芯片5分鐘后,進行明場成像實驗。


組織透化優化:

組織優化芯片包含8個捕獲區域:



組織透化具體步驟:

  1. 1)將芯片放在芯片盒中,陽性和陰性對照均不加透化酶。

  2. 2 ) 在透化30min的孔中添加70μl透化酶,放置在37°C的PCR適配器上。

  3. 3 ) 6分鐘后,向透化24min的孔中添加70μl通透酶,并在37°C的PCR適配器上孵育,

  4. 4) 重復此過程,直至27min后,向透化3min的孔添加70μl透化酶,放置在37°C的PCR適配器上。

  5. 5) 從每個孔中除去透化酶,陽性對照以外的所有孔中添加100μl 0.1X SSC,

  6. 6) 從每個孔中移出0.1X SSC。向每個孔中加入50μl Fluorescent RT Master Mix,將其放在預熱的PCR儀(設置條件)以啟動cDNA合成。

  7. 7) 從孔中吸出Fluorescent RT Master Mix,向每個孔中添加100μl 0.1X SSC,

  8. 8) 從每個孔中吸出0.1X SSC。向每個孔中加入70μl Tissue Removal Mix,然后放在PCR儀適配器上孵育,

  9. 9) 從孔中吸出Tissue Removal Mix。從芯片盒中取出芯片,浸入預熱的2X SSC-0.1%SDS中15次,浸入0.2X SSC中15次,浸入0.1X SSC中15次。

  10. 10) 在載片旋轉器中離心30s,確認芯片上沒有剩余的組織。

通過數字切片掃描儀在熒光場下進行掃描成像??梢悦黠@看出隨著透化時間的延長,熒光強度先逐漸增強,透化12min時熒光亮度達到最亮,而后逐漸減弱。



如果熒光強度接近,可以選擇較長的透化時間,防止透化不充分。但透化時間并不是越長越好,隨著時間增加,細胞內釋放的RNA會擴散,進入附近組織區域,放大看到海馬區結構模糊,或向邊緣擴散,沒有熒光信號的區域也出現了熒光信號。所以,在選擇最佳透化時間時,應綜合考慮熒光強度以及RNA擴散程度。

選擇最佳的透化時間后,就可以進行正式實驗了。正式實驗流程與組織透化優化的實驗流程基本一致,只是所用芯片不一樣。正式實驗用的基因表達芯片上有4個捕獲區域,其實驗流程為:

冷凍切片及貼片→甲醇固定→HE染色→明場拍照→透化→cDNA合成→第二鏈cDNA合成→變性→cDNA擴增→純化和質控→片段化,末端修復,加A→連接頭→樣本index PCR→上機測序。


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