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Visium空間轉錄組||烈冰生物關鍵技術——冷凍切片制備

時間:2020-05-25    |    閱讀量:1496

        空間轉錄組(Spatial Transcriptomics)是指保留組織內部精細區域的空間信息的全轉錄組測序。經過一次實驗,即可得到全部基因表達,并可比對至實驗過程中H&E染色圖像,達到圖像化數據和數字化數據的高度整合分析??臻g轉錄組學分析可以精確指示在特定的感興趣區域內激活了哪些信號通路,發生了怎樣的細胞間通訊,完成分子特征驅動病理特征的機制解析??臻g轉錄組以分子方式定義病理,完成了病理影像化至病理數字化結合病理影像化的革新,將在未來的精準醫療研究中發揮舉足輕重的作用。

前幾期,小編已經簡單介紹了Visium空間轉錄組的原理、實驗流程(【空間轉錄組】第一彈之原理與樣本制備,你都了解了嗎?),以及高分文章的實驗設計和研究思路,從小編分享的這幾篇空間轉錄組的高分文章中,可以看出冷凍切片的制備是整個空間轉錄組實驗的重點,決定了測序數據的質量。為了獲得能夠指示組織內真實表達水平的切片,實驗過程需要在低溫環境下快速完成,以確保組織內部RNA穩定性,這也極大考驗實驗人員的熟練度和專業性!

那我們今天就來說一說冷凍切片需要注意的問題。

1、切片的實驗設計

大部分組織樣本都遠超過芯片捕獲區域的面積(6.5mm X 6.5mm),因此,切割區域,切割剖面等實驗設計對于樣本利用率最大化、成本最低化十分重要。

2、切片的實驗設計

大部分組織樣本都遠超過芯片捕獲區域的面積(6.5mm X 6.5mm),因此,切割區域,切割剖面等實驗設計對于樣本利用率最大化、成本最低化十分重要。

3、冷凍切片厚度

空間轉錄組是以點陣(spot)為單位記錄組織切片的空間信息,芯片上每個spot直徑55μm,spot中心點之間距離為100μm,而不同類型的細胞大小差異較大,因此,切片厚度、切片的質量、細胞直徑決定了單點捕獲的細胞數量,從而影響空間轉錄組的解析分辨率。

為了獲得高質量、完整體現組織中基因表達水平的冷凍切片,烈冰搭建了先進的實驗平臺,并針對上述技術壁壘,不斷地探索練習進行實驗操作流程優化。

(一)實驗設計

烈冰團隊會根據研究方向與應用場景,與客戶深度溝通量身設計最適合的實驗方案,確保每一個實驗細節的有效實行。

  • 對于體積較大的人體腫瘤組織可以分成腫瘤中心、腫瘤邊緣、和正常對照等多個切片;疾病組織可以按照不同病變區域的組織形態進行切割。
  • 對于研究發育的課題,組織切片的選取尤其重要。針對不同時間、不同部位的組織采用連續切片或者間隔一定距離進行切片、亦或根據組織形態的差異等不同方式進行切片的選取等因素都需要根據課題的實際情況進行實驗設計。
  • 實驗過程與客戶保持密切溝通,針對切面進行HE染色和拍照,選取最有代表性、包含更多客戶感興趣區域的切片進行后續測序和分析,確保樣本組織利用率最大化和最大限度提高實驗的性價比。
  • 針對同一組織進行單細胞測序分析,整合空間轉錄組和單細胞測序分析,獲得高度一致性實驗數據 ,獲得更準確的空間層面的細胞分布信息。
  • 同時保留進行空間轉錄組測序的組織,為客戶后期進行FISH驗證提供高度一致的樣本,幫助獲得更可靠的實驗結果和更有說服力的實驗結論。

(二)冷凍切片的質量

烈冰已成功搭建頂級的實驗平臺,配置了先進的冷凍切片機LEICA CM1950。搭配切片經驗豐富的實驗團隊,為不斷優化冷凍切片及產品質量提供硬件和技術保障。

萊卡冷凍切片機:

電動切片、步進馬達確保冷凍切片的厚度、質量及切片間一致性;
精細的定位控制可以滿足對細微組織的精密切割;
強大的制冷系統為切片溫度提供了有力保障。

(三)冷凍切片的厚度

冷凍切片厚度應該根據組織類型有所調整,烈冰實驗團隊親自操刀實練,對多種組織類型進行測試優化并確定最佳的切片厚度。此外,也可以根據樣本類別以及客戶的個性化需求,具體設定切片厚度,確保獲得高質量的組織切片。

(四)冷凍切片的成像

掃描成像可能是影響組織切片原始圖像信息精度和準確度的重要因素。烈冰針對空間轉錄組成像裝置——熒光顯微鏡進行配置升級,以避免因切片高倍放大、多視野拍照導致的空間圖像缺失。

  • 尼康多熒光通路全自動掃描顯微鏡,可以實現明場和多種熒光染色成像,適用于各種植物、動物組織染色切片;
  • 配置優良的APO物鏡,確保圖像邊緣具有卓越的分辨率;
  • 搭配電動載物臺,精確控制樣本的移動路徑,獲取完整的組織切片成像信息。

五)完善的SOP實驗流程

烈冰經過大量實操演練,制定了嚴謹規范的實驗室標準操作流程(SOP)并嚴格遵守,并根據客戶的不同樣本不斷進行優化,確保前期獲得最優樣本。

(六) 充足的耗材庫存

烈冰的充足耗材庫存助力客戶樣本第一時間完成實驗,助力實驗快人一步。



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