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【空間轉錄組】第一彈之原理與樣本制備,你都了解了嗎?

時間:2020-04-08    |    閱讀量:1102


烈冰生物已經正式推出了Visium空間轉錄組測序及數據分析服務,(技術搶先看|全新空間轉錄組測序數據分析策略來咯~)為了更好地幫助客戶理解空間轉錄組測序,得到完美的組織切片,獲得最優質的數據分析結果,本期開始,小編將為大家詳細介紹空間轉錄組測序的原理、樣本制備、實驗流程、案例分析、文章解讀等信息。


其實,空間轉錄組的概念早在2016年就已經存在了,目前已經發表的空間轉錄組技術有 Slide-seq、LCM-seq、seqFISH、MERFISH、Liver single cell zonation以及 Tomo-seq。但是這些方法存在操作復雜、檢測精度不準確、基因和細胞檢測量的限制等問題,無法大規模商業推廣。


基于Spatial Transcriptomics升級改進后的Visium空間轉錄組,是目前唯一一款高精度、高通量的商業化空間轉錄組測序方案,工作流程簡單,從組織切片到文庫構建僅需一天,大大節省時間成本。其本質是通過空間條形碼捕獲探針,高通量的原位檢測冷凍組織切片中不同區域的RNA的表達模式以及空間分布。

當組織冷凍切片附在帶有spatial barcode的空間轉錄組載片上時,通過探針上條形碼引物結合并從組織中捕獲鄰近的mRNA。被捕獲的mRNA開始逆轉錄,得到的cDNA中包含了spatial barcode序列。通過上機測序,可以將每個mRNA轉錄的序列映射回組織切片中的起始位置。

Visium空間轉錄組的核心在于載玻片部分,正式文庫構建的載玻片上有4個捕獲區域(6.5mm X 6.5mm,可以加4個樣本),每個捕獲區域含有約5000個被條形碼標記的點(barcoded spots),每個spot直徑55μm,spot與spot中心點之間的距離為100μm,每個 spot含有上百萬個可以與mRNA結合的捕獲探針,每個探針上都帶有獨特的spatial barcodes,用以標記捕獲的mRNA的空間位置。



空間轉錄組實驗流程

因為空間轉錄組測序是對組織切片進行操作,需要將組織進行切片。因此客戶在制備樣本時,需要將新鮮的組織凍存并進行OCT包埋。 后續的冷凍切片、RNA 捕獲及文庫構建等操作可以視具體情況帶回公司進行實驗。

1、組織凍存

將組織進行凍存的目的是為了得到保護RNA的質量及組織形態的完整,從而真實的反映出細胞和基因在空間中的分布情況。因此,拿到新鮮組織后,需要對組織樣本進行異戊烷速凍。

2、OCT包埋

OCT是一種固形劑,在冰凍切片時可以支撐組織,增加組織的連續性,減少皺折及碎裂,以保存組織結構完整性。


3、冷凍切片

將質檢合格的冷凍組織和10x玻片先放-20℃冷凍切片機箱體中平衡30分鐘以上,再進行切片。


4、文庫構建


將組織切片貼合在帶有mRNA結合捕獲探針的載玻片上,通過甲醛固定、H&E染色拍照得到組織切片的形態結構。再進行透化處理,使細胞中的mRNA釋放,并結合到芯片相鄰的捕獲探針上。將捕獲的mRNA反轉錄合成cDNA構建測序文庫進行上機測序,從而獲取基因表達信息。







總體來說,空間轉錄組的實驗流程包括:組織凍存-OCT包埋-冷凍切片-固定染色-組織透化-cDNA合成及建庫-上機測序,而需要客戶進行樣本準備的步驟相對簡單:組織凍存與OCT包埋。


空間轉錄組測序專題


1

單細胞轉錄組聯合空間轉錄組學||揭示骨髓造血微環境的分子,細胞和空間組織構

2

技術搶先看|全新空間轉錄組測序數據分析策略來咯


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